Основные популяции лимфоцитов периферической крови и их значения в группе практически здоровых лиц

Для оценки референсных значений интервалов субпопуляций лимфоцитов практически здоровых лиц при помощи многоцветного цитометрического анализа исследовали периферическую кровь 21 донора в возрасте от 23 до 68 лет (10 женщин и 11 мужчин). Сравнение полученных результатов с литературными данными свидетельствует о близости референсных интервалов распределения основных популяций клеток иммунной системы. Однако остается открытым вопрос о критериях нормальных показателей клеточного иммунитета, связанных с региональными особенностями отдельных областей и этническими группами населения РФ. Все это требует дальнейших научных исследований в данной области.

В последние десятилетия одним из достоверных методов оценки параметров клеточного иммунитета является метод проточной цитометрии.

Этот метод позволяет при использовании небольшого количества цельной крови или выделенных мононуклеаров периферической крови определить количество клеток, несущих те или иные маркеры. Уникальность метода состоит в том, что он дает возможность получить достоверные и воспроизводимые результаты, характеризующие фенотип каждой клетки.

В последнее время метод проточной цитометрии применяется для исследования не только поверхностных маркеров, таких как дифференцировочные антигены, но и для оценки числа клеток с внутриклеточной и мембранной формами цитокинов. Созданная для ускорения анализа в клинической цитологии и других дисциплинах, этатехнология постепенно развилась в эффективный подход к решению многих важных задач биологии клетки, иммунологии, клеточной инженерии и т. д.

Проточная цитометрия базируется на арсенале современных цитохимических флуоресцентных методов анализа структурных компонентов клеток, их антигенов и внутриклеточных процессов. От классической цитохимии проточную цитометрию отличает высокая производительность. Так, исследуются выборки от нескольких тысяч до нескольких миллионов клеток, что гарантирует статистическую достоверность результатов.

В свою очередь, от классической биохимии и молекулярной биологии современную цитометрию отличает возможность анализировать не усредненные молекулярные характеристики по всей популяции, а индивидуальные параметры для каждой из клеток.

Таким образом, высокий уровень автоматизации, простота в эксплуатации и небольшие размеры современных приборов позволяют рассматривать их не только как исследовательские, но и как клинико-диагностические. Многоцветный цитометрический анализ используется не только для определения показателей иммунного статуса пациентов, но и для диагностики лимфопролиферативных заболеваний.

Очень важным разделом для биологии и медицины при появлении новых методик исследования является формирование нормативных показателей. Не является исключением и проточная цитометрия.

В 1986 году в первом документе*, регламентирующем деятельность иммунологических лабораторий, в минимальный объем иммунологического исследования были включены Т- и В-лимфоциты. В дальнейшем этот перечень был изменен и расширен** за счет включения Т-хелперов, Т-цитотоксических и естественных киллеров.

* Приказ Минздрава СССР № 539 от 18.04.1986 «Об организации лабораторий клинической иммунологии».
** Приказ Минздрава № 380 от 25.12.1997 «О состоянии и мерах по совершенствованию лабораторного
обеспечения диагностики и лечения пациентов в учреждениях здравоохранения Российской Федерации».

В соответствии с медицинскими стандартами (протоколами) диагностики и лечения больных с аллергическими заболеваниями и нарушениями иммунной системы для выявления дефектов иммунной системы необходимым является обязательное определение субпопуляций лимфоцитов и последующий контроль выявленных нарушений после курсатерапии. На данный момент нет единого протокола референсных значений для оценки иммунного статуса человека на территории РФ.

Для оценки интервала нормальных значений популяций лимфоцитов периферической крови при помощи многоцветного цитометрического анализа мы обследовали периферическую кровь 21 практически здорового лица в возрасте от 23 до 68 лет (10 женщин и 11 мужчин).

Панель моноклональных антител (МА), использованная для окрашивания лимфоцитов, приведена в таблице 1. Моноклональные антитела фирмы Beckman Coulter (США) были мечены FITC (изотио-цианат флуоресцеина), PE (фикоэритрин), PC 5 (комплекс PE с цианином-5), ECD (комплекс PE с техасским красным), РС 7 (комплекс PE с цианином-7) и АРС (аллофикоцианин). Подготовку клеток периферической крови человека (ПКЧ) для многоцветного анализа проводили в соответствии с инструкцией производителя антител (Beckman Coulter, США). Для удаления эритроцитов пробоподготовку проводили по безотмывочной технологии с использованием лизирующего раствора OptiLyse C (Beckman Coulter, США). Анализировали окрашенные клетки на проточном цитофлуориметре Navios ТМ-6 Colors/2 (Beckman Coulter, США). Абсолютное количество субпопуляций лимфоцитов определяли как в одноплатформенной (с помощью реагента Flow Count (Beckman Coulter, США)), так и в двухплатформенной (по результатам гематологического анализатора LH500 (Beckman Coulter, США)) системах.

Математическую обработку цитометрических данных проводили при помощи программ CXP FC 500 (Beckman Coulter, США). Результаты анализа представлены в виде процентилий с достоверностью 0,05.

Таблица 1. Панель многоклональных антител, использованная для анализа популяции лимфоцитов периферической крови практически здоровых доноров

Границы референсных интервалов относительного и абсолютного количества популяций лимфоцитов, несущих соответствующие поверхностные антигены, являются необходимым звеном интерпретации результатов. На сегодняшний день данные литературы о референсных интервалах колеблются в широких диапазонах [1, 2, 4, 6, 8, 9, 17, 19, 24]. Исследования в данной области широко велись и ведутся как отечественными, так и зарубежными учеными-исследователями и представлены в таблице 2.

Таблица 2. Относительное содержание основных субпопуляций лимфоцитов в периферической крови взрослых здоровых доноров по данным литературы (среднее арифметическое и диапазон значений)

Таблица 3. Содержание субпопуляций лимфоцитов в периферической крови практически здоровых доноров в настоянием исследовании (диапазон значений)

Оценка как относительного, так и абсолютного количества В-клеток является одним из важных диагностических показателей. У обследованных нами лиц (таблица 3) содержание В-лимфоцитов соответствует литературным данным, однако верхние границыреференсного диапазона этого показателя в нашей группе заметно ниже, чем у других авторов (таблица 2), средний уровень CD19+ (относительное значение) ниже границ референсных интервалов, предлагаемых другими исследователями (таблица 2). Для выявления В-лимфоцитов используют так называемые линейноспецифические маркеры. В- клетки экспрессируют целый ряд мембранных молекул, которые необходимы для формирования В-клеточного рецептора (В-cell Receptor, BCR) и являются маркерами линейной принадлежности B-клеток. В нашей работе мы использовали CD19+ и CD45+.

Анализ относительного и абсолютного количества Т-клеток получил широкое распространение в практике диагностических лабораторий, так как при фенотипировании лимфоцитов эти данные являются диагностически значимыми при первичных и вторичных иммунодефицитах. Снижение абсолютного количества Т-лимфоцитов в крови свидетельствует о недостаточности клеточного иммунитета, повышение – о гиперактивности иммунитета и наличии лимфопролиферативных заболеваний. Так, например, содержание Т-лимфоцитов у обследованных лиц в нашей работе (таблица 3) составило 66,13–79,06 в % и 1,181 – 2,264 × 10 × 9/л, это ближе всего соответствует данным методических рекомендаций 1999 года (таблица 2). Аналогичная ситуация характерна и для Т-хелперов, так как ближе к полученному диапазону значений (37,47– 51,249) находятся результаты, представленные в литературе.

Референсные значения данных лабораторий вошли в методические рекомендации стандартизации методов иммунофенотипирования клеток крови и костного мозга человека.

NK-клетки обладают противовирусной, противоопухолевой цитотоксической активностью, а также участвуют в регуляции адаптивного иммунного ответа, продуцируя большое количество цитокинов и хемокинов. Снижение или увеличение количества NK- клеток вполне возможно. Чаще наблюдаются ситуации, когда количество естественных киллеров повышено, это наблюдается при воспалительных процессах, вирусных инфекцих, онкологии и других ситуациях, требующих напряженной работы цитотоксических клеток.

Реже содержание естественных киллеров снижено, что обнаруживается в случае иммунодефицита, в том числе врожденного. В нашей работе значения (%) NK колеблются от 8,65 до 24,68, данные значения ближе всего соответствуют референсному диапазону показателей населения Челябинской области.

Для идентификации NK-клеток среди других лимфоцитов используют комбинацию из нескольких маркеров, таких как CD16 и CD56. Однако Т-клетки также могут экспрессировать на своей поверхности CD56 и CD16 (так называемая популяция T-NK- клетки). Для разделения этих популяций используют молекулу CD3, так как NK-клетки никогда ее не экспрессируют.

Дубль-позитивные CD4+ CD8+ лимфоциты периферической крови являются высокодифференцированными клетками памяти, которые имеют большое значение в развитии реакций адаптивного иммунитета в ответ на различные инфекционные агенты [18, 21, 22, 23]. Пределы колебаний уровня таких клеток в группе обследованных нами здоровых лиц представлены в таблице 3. Значения верхней границы значительно превышают данные авторов приведенной работы, однако, вероятно, они являются отражением этого показателя в данном регионе.

Уровни популяции лимфоцитов CD95+, CD25+ в нашем исследовании выходят за пределы предложенных, то есть ниже, чем у других авторов. В использованных нами литературных источниках не приведены референсные интервалы для таких показателей, как уровень CD71+, CD38+, поэтому сравнения в данной статье не представлены.

Приведенные нами результаты исследования субпопуляций лимфоцитов практически здоровых лиц Московского региона представляют собой современную картину состояния иммунной системы, которые могут быть использованы для оценки ее нарушений при первичных и вторичных иммунодефицитах.

Таким образом, проведенные нами исследования иммунного статуса практически здоровых лиц позволили определить интервалы нормального распределения содержания субпопуляций лимфоцитов. Сравнение полученных результатов с литературными данными (таблица 2), опубликованными в зарубежной и отечественной литературе, свидетельствуют о близости референсных интервалов распределения основных популяций клеток иммунной системы практически здоровых лиц. Однако остается открытым вопрос о нормах в Российской Федерации, связанных с региональными особенностями отдельных областей и этническими группами населения. Все это требует дальнейших научных исследований в данной области.

В нашей работе был проведен сравнительный анализ определения абсолютного содержания субпопуляций лимфоцитов одноплатформенным (с использованием Flo Count (Beckman Coulter, США) и двухплатформенным методами.

На рисунке представлены результаты определения СD3+ у 10 практически здоровых лиц.

Как видно из рисунка, использование Flow Count в целом соответствует колебаниям абсолютного содержания популяций лимфоцитов, хотя и значимо занижает результаты. Поэтому использование двухплатформенного метода определения количества популяций лимфоцитов является предпочтительным. Однако при отсутствии такой возможности использование Flow Count является допустимой альтернативой.

В данной работе мы также проанализировали влияния временного интервала с момента взятия крови пациента до проведения исследования показателей иммунного статуса в течение 24 часов. На рисунке 1 отмечено, что абсолютное количество СD3 клеток в контрольной группе в течение 24 часов существенно не изменилось.

Анализ субпопуляций лимфоцитов периферической крови является важным инструментом в оценке результатов клинической диагностики и исследовательских задач иммунологии. Периодическая оценка и установление референсных диапазонов необходимы в лабораторной практике для выявления патологии и контроля эффективности терапии. Более достоверным методом для определения абсолютного количества субпопуляций лимфоцитов является двухплатформенный. При необходимости транспортировки образцов крови до начала исследования методом проточной цитометрии значительных изменений показателей в течение 24 часов не наблюдается.